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Requisite aqui os nossos serviços:  

 

Formulário de Requisição de Serviço

 

Faça o download do formulário acima, preencha-o segundo as recomendações e envie-nos para o seguinte e-mail : luz.fernandes@dq.fct.unl.pt  

As nossas recomendações têm como objectivo proporcionar um serviço o mais eficiente possível.  

 

 Recomendações:

1- Amostras para separação por electroforese bidimensional

         - Concentração das amostras 
         - Detergentes 
         - Interferências de sais

  2- Amostras para análise por MALDI-TOF

         - Contaminações 
         - Reagentes compatíveis com o MALDI-TOF 
         - Procedimento das amostras 
         - Quantidade de amostra 
         - Envio de amostras

        

Electroforese-2D  

Concentração das amostras 

As amostras devem apresentar-se com uma concentração aproximada de 1 a 10 mg/mL.  
Em função da quantidade de amostra a electroforese pode dividir-se em analítica ou preparativa.  

- Na electroforese analítica é colocada uma pequena quantidade de amostra, cerca de 50μg - 200μg de proteínas totais. Este tipo de electroforese é utilizada para obter mapas de proteomas.

- Na electroforese preparativa, a quantidade de amostra colocada é bastante superior, entre 500μg a 1mg. Aqui a electroforese é utilizada para isolar as manchas de proteínas que posteriormente serão identificadas por MS.

Detergentes

Os detergentes têm um papel importantíssimo na solubilização das proteínas, mantendo-as dissolvidas durante a separação na primeira dimensão. Uma das características que os detergentes, compatíveis com a primeira dimensão, devem possuir é ter a capacidade de não modificar a carga global das proteínas, pois é esta característica que vai permitir a separação.

Os detergentes aniónicos são utilizados nas amostras que vão ser separadas por electroforese bidimensional. Alguns dos exemplos são: os CHAPS, CHAPSO, C7BzO ou ASB-14.

Interferência de sais

Os sais podem interferir no processo de focagem isoeléctrica. Pelo que se devem reduzir ao máximo. Os sais produzem um aumento da condutividade. A focagem das proteínas na primeira dimensão não deve ser iniciada sem antes os iões dos sais se terem deslocado para as extremidades das bandas. Uma concentração elevada de sais pode provocar deslocações horizontais nos géis devido à deficiente focagem das proteínas.

A gama de concentração dos sais na primeira dimensão vai depender do tipo de carga da amostra.

- Quando a amostra é colocada na banda ao mesmo tempo que se realiça a rehidratação, a concentração de sal deve ser inferior a 10mM.

- Quando a amostra se aplica após rehidratação, a concentração pode chegar até aos 50mM.

  

MALDI-TOF-MS

Contaminantes

Durante todo o processo de preparação de uma amostra com fim à análise por espectrometria de massa (MS), é fundamental que todo o material esteja bem limpo antes de ser utilizado (usar material lavado com água mili-Q, mas não autoclavado). È imprescindível o uso de luvas para evitar contaminações com outras proteínas (ex. queratinas), que se encontram no cabelo, pele, alguns tipos de roupa, ect...e que vão dificultar a identificação das proteínas em estudo.

Reagentes compatíveis com a MS tipo MALDI-TOF

Utilizar sempre reagentes com grau de pureza HPLC e água mili-Q

A) Os compostos que não interferem com o MALDI-TOF são: ác. Trifluoracético, ác. Fórmico, beta-mercaptoetanol, DTT, solventes orgânicos voláteis, HCl, NH4OH, ác. Acético.

B) Compostos de concentrações inferiores a 50 mM não interferem com a espectrometria de massa: HEPES, MOPS, Tris, NH4O, ac. Octilglucósido.

C) A evitar os seguintes compostos: glicerol, azida sódica, DMSO, SDS, fosfatos, NaCl, 2M Urea, 2M Guanidina.

Preparação da amostra

As amostras podem ser de vários tipos, uma proteína em solução, uma banda (gel monodimensional) ou uma mancha proteica (gel bidimensional) separada em poliacrilamida, tingida com azul de Coomassie ou com prata (prata compatível com espectrometria de massa) cuja fixação ao gel não seja irreversível (ver protocolos).

 Quantidade de amostra

A concentração de péptidos ou proteínas para a análise por MS encontra-se entre os 5 fmol/μL e 1pmol/ μL (1 pmol/ μL = 10^-6M). A quantidade referenciada engloba as proteínas detectadas mediante coloração com azul de Coomassie e a maioria das proteínas detectadas por coloração com prata. 

Envio de amostras

a) Se a amostra é proveniente de um gel de poliacrilamida, recortar a mancha proteica com o mínimo de gel possível evitando também transportar outras proteínas que se encontrem em manchas muito próximas. As manchas de um gel monodimensional podem ser recortadas com um bisturi limpo. As manchas de um gel bidimensional podem ser retiradas com a ponta de uma pipeta recortada (aproximadamente 1,5 mm²). È fundamental enviar um scanner ou fotocópia da imagem do gel juntamente com as amostras.

b) A porção de gel que contém a mancha proteica deve ser colocada num tubo eppendorf  recoberto com água mili-Q.

c) As proteínas (ou a mistura de péptidos) podem ser enviadas liofilizadas.